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PCR仪温控性能及常见问题分析

更新日期:2017年12月7日 大字 小字
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PCR 技术自发明以来已经三十多年,一直广泛应用于分子生物学的各个领域,普通定性PCR在基础研究中仍旧是不可或缺的环节。今天小宝来聊一聊定性PCR仪最为实验人员关注的温控性能和常见问题。


一、PCR仪温控性能解读
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对普通PCR仪来说,温度控制指标主要是指温度的准确性、均一性、以及升降温速度




温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的一致性,它直接关系到实验的成败。如果排除样品加入过程中的失误操作问题,对于PCR反应而言最重要的莫过于温度控制的准确性。

 

温度的均一性是指样品孔间的温度差异,它关系到在不同样品孔进行反应结果的一致性。


宝予德Life Eco PCR基因扩增仪,采用专利的TAS技术,通过特殊的高分子材料处理有效的避免了热传导的边缘效应。



升降温的速度是指在PCR不同反应阶段温度升降的速度。显然,更快的升降温速度,可以缩短反应所需的时间,而且有效降低由于升降温过程产生的非特异性结合、缩短了反应的时间,能提高PCR反应的特异性。

但是,值得注意得是仪器的升降温速度和样品管中的样品的升降温速度并非同一回事,因为样品管与基座接触的紧密性、导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度。


 


Life Eco具有两种控温模式:Block控温模式、Tube控温模式。在Block模式下,仪器会根据探测器直接探测的温控模块的温度进行控制,这种模式适用于长时间的静态孵育,如连接、酶切、去磷酸化等。Tube模式实际上是一种模拟试管/PCR板的温控模式,根据探测器所探测到的温控模块的温度由微计算机计算出管内/PCR板孔内样品液的温度来进行控制。一般说来,Tube模式更为准确,因为管内样品的温度无法与温控模块同时达到预设温度。因此小宝建议在应用LifeEco PCR基因扩增仪时采用Tube控温模式。



二、PCR实验常见问题及解决方法
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1. 阴性对照和阳性对照都出现阳性扩增带

原因

①阴性样品和PCR 反应试验污染。

②电泳上样时避免PCR 产物漂移到其他孔而影响结果判定。

解决方法

①更换全部试剂,必要时更换所有移液器。

②应小心操作,或琼脂糖凝胶加厚,增加每孔的容量,可避免加样液的溢出。

2. 阳性对照呈阴性

原因

①阳性样品或加入阳性模板失效。无论是组织还是血清,冻融1 次后病原数量明显减少。

②加入试剂量不准确或遗忘了某一成分。

解决方法

①将阳性对照样品分成小包装。每个包装够用1 次最好。

②仔细核对试验记录,校对移液器。


3. 出现非特异扩增带

原因

①样品模板量过多。

②引物或TaqDNA 聚合酶多。

镁离子浓度过高或退火温度过低。

解决方法:

依据具体实验的情况,分析上述可能出现的原因,采取相应的措施。


4. 阳性对照扩增带弱

原因

①电泳时琼脂糖中EB含量少或长时间后再用已失效。

②扩增效率不高。

解决方法

①是将琼脂糖凝胶放入含有EB 电泳液中再染30 min 后再观察。

②检测仪器是否正常工作。

③增加纯化DNA cDNA 样品的稀释倍数。




扩增效率不高的原因

a.反应体系问题,操作中加入缓冲液、TaqDNA 聚合酶、引物等不准确,造成不能达到最佳反应体系。

b.仪器不能正常工作。

c.样品处理过程中残留有较多PCR 反应抑制物造成的。多数情况是由于操作者怕PCR 不出阳性,有意无意提高PCR 检测样品量造成的。


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